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西湖大学马丽佳团队发现转肽酶Sortase结合核酸分子并介导核酸分子标记细胞

转肽酶Sortase是革兰氏阳性菌中保守且广泛存在的一类膜蛋白和毒力因子。例如,金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)中的转肽酶A(SaSrtA),能够通过一种被称为转肽反应的过程将多种细菌蛋白定位到细菌表面,介导细菌对宿主细胞的侵袭、细菌生物膜形成等过程。


除了重要的生物学功能,SaSrtA催化下的转肽反应能够将一个C端包含五肽序列(LPXTG)的蛋白连接到另一个N端具有寡聚甘氨酸链的蛋白上。是一种被广泛使用和改造的蛋白质工程工具。


尽管sortase在转肽反应中的生物学功能和作为蛋白质或多肽连接工具的工程学应用被长期研究,这种重要蛋白与核酸分子之间的相互作用却从未被报道。


北京时间2024年4月5日,西湖大学生命科学学院马丽佳团队在 Advanced Science 上发表了题为"The transpeptidase sortase A binds nucleic acids and mediates mammalian cell labeling"的研究成果。


文章链接:

http://doi.org/10.1002/advs.202305605


文章截图:

团队首先发现一种以金黄色葡萄球菌转肽酶A(SaSrtA)为起点、经工程化改造后的转肽酶mgSrtA(JACS 2019, Peng CHEN Group)能够将核酸分子标记到哺乳动物细胞表面(图1A)。该细胞标记方法条件温和、标记效果稳定、适用于多种永生化细胞和原代细胞,因此非常适合在单细胞测序实验中标记不同来源的细胞样品,为一些很有挑战的单细胞实验场景提供解决方案,如提前标记和混合样品以避免批次效应、混合珍稀或极少量样品以满足实验起始量要求等。研究人员设计了一个混合八种不同细胞的scRNA-seq实验,证明了利用mgSrtA给细胞加上核酸分子标记应用于单细胞测序中的优秀潜力,并将mgSrtA介导的多样品核酸标记方法命名为CellID(图1B)。

图1. 转肽酶Sortase结合核酸分子并介导核酸分子的细胞表面标记


随后,研究人员探索了mgSrtA介导核酸分子标记哺乳动物细胞的机制。通过一系列生化实验和细胞标记实验,研究人员发现mgSrtA与含有G碱基的DNA寡核苷酸链有更强的相互作用。并且,其他含有核苷酸碱基单元的分子(如RNA寡核苷酸链、肽核酸(PNA)和双链DNA等)也能被其标记到细胞表面。


为了验证mgSrtA结合核酸分子是否依赖于转肽酶的转肽活性,研究人员对mgSrtA的转肽活性中心进行了多个氨基酸点突变。结果证明,失去转肽活性的mgSrtA突变体无法与其转肽底物(含LPETG多肽)结合,但仍然能够结合DNA寡核苷酸。而已知能够促进转肽反应的Ca2+并不影响mgSrtA与核酸分子的相互作用,反而Cu2+能显著提升mgSrtA与核酸分子的结合。由此可见,mgSrtA与核酸分子的相互作用很可能依赖于未知机制而非转肽活性。


在对被标记的细胞表面进行成像实验后,研究人员又意外发现mgSrtA与被标记在细胞表面的核酸分子有明显的共定位,并且两者的信号强度具有强相关性。那么,mgSrtA是否作为标记产物的一部分桥接了核酸分子到细胞表面呢?


为了寻找细胞表面参与了标记过程的分子,研究人员使用CRISPR全基因组文库筛选影响细胞标记效率的基因(图2A)。结果证明,细胞表面的糖胺聚糖(glycosaminoglycan, GAG)与mgSrtA介导的核酸分子细胞标记过程密切相关(图2B-C)。而且,在前述报道的mgSrtA介导的多肽细胞标记中,GAG很可能也参与了mgSrtA桥接多肽到细胞表面的过程。


图2. CRISPR screening发现GAG参与了mgSrtA介导的核酸分子细胞表面标记


由于mgSrtA是从金黄色葡萄球菌转肽酶A(SaSrtA)进化而来,研究人员好奇mgSrtA与核酸分子的相互作用是SaSrtA本身就具有的性质,还是在定向进化和理性设计改造中出现的新性质?


生化和流式实验证明,SaSrtA天然具有与核酸分子结合的能力,但是因为其自身无法与细胞表面结合,所以也无法将核酸分子标记到哺乳动物细胞表面。通过分析从SaSrtA向mgSrtA改造过程中的其他中间体蛋白,研究人员发现SaSrtA的F200L突变对其结合到哺乳动物细胞表面的能力至关重要。


通过进一步分析更多来自不同革兰氏阳性菌的野生型sortase,研究人员证实sortase与核酸结合并介导其标记细胞的性质很可能广泛存在于革兰氏阳性菌中(图1C),可能给细菌提供了某些有利于适应性的功能。


Sortase的转肽酶活性使其在病原微生物研究和蛋白质工程、细胞工程等应用研究中一直受到关注。本文所提及的工作首次发现了体外表达的sortase蛋白与核酸和哺乳动物细胞表面都存在相互作用,拓展了人们对革兰氏阳性菌中sortase的潜在生物学功能和sortase作为工具蛋白应用范围的认知。


从生物医学研究的角度,这项研究证明了来自多种不同革兰氏阳性菌的sortase都能结合核酸分子。进化上的保守性让我们推测这种能力对于细菌适应性具有正向作用。生物膜与sortase、生物膜与核酸分子的关系已经多有研究,如果能够进一步建立起细菌内源sortase与细菌胞外环境中核酸分子的联系,将为我们理解生物膜、开发抗菌药物提供线索。


从应用角度,由于核酸序列本身易合成、且能被高通量解析,本文展示的 CellID技术还可以被应用于动物体内,实现in vivo细胞标记、细胞时序标记等。


这项研究还展示了sortase作为核酸药物递送工具的潜力。在一个对标记后细胞进行长时间观察的实验中(120小时),研究人员发现被mgSrtA标记到细胞表面的核酸分子随后会进入细胞内部,且核酸分子编码的蛋白(如GFP)能够在细胞内表达。当然,仍需要对sortase递送核酸的种类、长度、序列组成、修饰等属性进行系统探索和优化,才能验证和释放sortase作为核酸递送工具、特别是核酸药物(如ASO,siRNA)递送工具的价值。


西湖大学博士研究生刘颖政、陆志科,访问学生吴攀峰为本论文的共同第一作者。西湖大学余振兴博士、西湖云谷智药梁兆辉博士和倪科博士均对本文的研究工作做出了重要贡献。西湖大学生命科学学院特聘研究员马丽佳是本文的通讯作者。本研究受到西湖实验室、西湖大学未来产业研究院、西湖教育基金会的资助。


马丽佳团队专注于开发新一代基因治疗技术,围绕治疗靶点发现、基因编辑工具开发、治疗载体设计、递送系统开发等问题开展研究。团队擅长开发和使用高通量实验技术,特别是功能基因组学技术,结合计算生物学和机器学习,通过数字化生物学过程来理解基因组的解码过程、开发新型基因治疗工具。欢迎有共同兴趣的研究人员加入,请联系:

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