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化学调控氟硼二吡咯类染料的荧光寿命并应用于多重荧光寿命成像丨理学院张鑫团队发布最新成果

近日,西湖大学理学院张鑫团队在《Angew. Chem. Int. Ed.》上发表了题为“Chemical Control of Fluorescence Lifetime towards Multiplexing Imaging”的研究成果。

研究团队通过化学调控光致电子转移(PET)以及分子内电荷转移(ICT)过程,在绿色和红色光谱通道内成功实现了氟硼二吡咯类染料荧光寿命的系统性调控,并开发了可应用于体外和体内多重荧光寿命成像的分子库,为系统性调控荧光小分子的荧光寿命提供了新的方法,并推动基于荧光小分子的多重荧光寿命成像的发展。

西湖大学博士后马俊宝、博士生罗峰为文章的共同第一作者,西湖大学化学系张鑫教授、郑州大学丁丽娜副教授和南京师范大学沈宝星副教授为文章通讯作者。

荧光寿命成像(FLIM)技术目前已经成为了化学生物学研究的重要工具。与传统的基于荧光强度的成像方式相比,荧光寿命不受激发光强度以及荧光分子浓度变化的影响,但是受分子本身所处的微环境如粘性、极性、温度以及pH等的影响,因此更适合应用于生物体系中微环境的定量成像。同时荧光寿命在荧光强度基础上增加了额外的成像通道,通过应用具有不同荧光寿命以及相似的光谱性质(激发以及发射波长)的荧光探针,我们可以实现在同一光谱通道内同时对多个靶标进行多重荧光寿命成像。但是现有的多重荧光寿命成像主要通过选择已有的不同种类的探针分子实现,成像通道数受限于同光谱通道内这些分子的种类以及较小的荧光寿命变化范围。调控同种类分子的荧光寿命并得到一系列具有不同荧光寿命的分子库可以极大地拓展多重荧光寿命成像的通道数,但是到目前为止,调控荧光小分子的荧光寿命仍然缺乏系统性研究。

图1. 取代基电性和位阻对绿色BODIPY荧光寿命的影响

作者选择了氟硼二吡咯(BODIPY)这类被广泛应用于化学、生物以及材料领域的荧光团作为模板进行研究。BODIPY类染料母核发射明亮的绿色荧光,它具有高荧光量子产率、亮度、光稳定性以及良好的生物相容性,在其8位引入强吸电子/供电子芳基取代基后,激发态分子会发生光致电子转移(PET)过程淬灭荧光。作者推测该过程同样会改变分子的荧光寿命,因此在BODIPY分子8位引入了不同电性和位阻的取代基,并研究了它们的光物理性质(图1)。作者发现随着取代基吸电子效应和供电子效应的增强,其荧光寿命呈现下降趋势,硝基和二甲氨基取代后引发强烈的PET过程,使荧光完全淬灭。由于BODIPY分子发生PET过程时,其8位芳基取代基和荧光母核之间的二面角会发生变化,因此作者尝试在芳基取代基邻位引入位阻阻止激发态分子旋转,从而调控荧光寿命,作者发现邻位取代基可以显著增加荧光寿命。结合这两种策略,作者成功实现了绿色光通道内荧光寿命的系统性调控,并合成了一系列具有不同荧光寿命分布(1.5 - 6.4 ns)的分子库。

2. 取代基电性对红色BODIPY荧光寿命的影响

接着作者在BODIPY分子5位引入芳基取代基拓展了π共轭体系,使其发射光谱红移至红色光通道。改变5位接入的取代基的电性可以调控激发态分子的分子内电荷转移(ICT)过程,作者猜测该过程同样会影响荧光寿命。因此作者合成了一系列不同电性效应的5位取代基的分子,研究了其光物理性质(图2)。作者发现随着取代基吸电子效应的增强,荧光寿命也逐渐增加,同时发射光谱发生蓝移,这支持了取代基电性变化导致激发态ICT过程的变化,后续的DFT计算结果也证实了这一推论。通过这种策略,作者成功实现了红色光通道内荧光寿命的系统性调控,并合成了一系列具有不同荧光寿命分布(3.3 – 5.6 ns)的分子库。作者随后考察了两个分子库中的分子的荧光寿命在不同的粘度以及极性环境中的变化,发现它们受环境影响很小,适合用于多重寿命成像。

图3. 靶向不同蛋白的多重荧光寿命成像

作者首先合成了具有不同荧光寿命的分子的琥珀酰亚胺酯,将其分别标记在两个可以发生液液相分离弹性蛋白样多肽(ELP)的氮端,在体外形成液滴后,通过FLIM可以清晰的拆分显示出不同荧光寿命的液滴 (图3a, 3b)。利用同样的策略,连接自标记蛋白标签Halo-tag以及SNAP-tag的探针分子在分别标记了融合了SNAP标签的核磷蛋白NPM1以及融合了Halo标签的组蛋白H2B后,作者可以在U-2 OS细胞内通过FLIM对两者进行寿命拆分(图3c, 3d)。


图4. U-2 OS细胞内靶向不同细胞器的多重荧光寿命成像

体内实验中,作者首先合成了连接有靶向内质网和溶酶体基团的不同荧光寿命的探针分子,作者应用FLIM实现了在红色和绿色通道内对U-2 OS细胞内的内质网和溶酶体的同时成像,并成功对两者进行了寿命拆分(图4)。以上实验显示了通过化学调控建立的具有不同荧光寿命的分子库在多重荧光寿命成像中的应用潜力。

本研究为系统性调控BODIPY染料的荧光寿命提供了有效的方法,在两个光谱通道内建立了可以应用于体外和体内多重荧光寿命成像的分子库,并且类似的策略可能适用于其他种类荧光团的荧光寿命调控。

西湖实验室助理研究员熊家亨、西湖大学博士生戴嘉楠、博士后谈自主以及博士后叶松涛对本项研究提供了帮助。该研究得到了西湖大学未来产业研究中心、西湖实验室、中国博士后科学基金和国家自然科学基金的支持。

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